22.10.2024
Как растут эмбрионы?
Первым этапом культивирования эмбрионов в лаборатории является оплодотворение. Оплодотворение проводят через 40 - 41 час после введения триггера. Метод оплодотворения (IVF или ICSI) выбирают на основании показателей спермограммы партнера в день пункции и анамнеза пары.
Через 17-19 часов после оплодотворения под микроскопом оценивают зиготы (оплодотворившиеся яйцеклетки) на наличие пронуклеусов. В норме у зиготы формируются 2 пронуклеуса. К аномально оплодотворившимся относятся гаплоиды – с одним пронуклеусом, полиплоиды - с тремя и более пронуклеусами и зиготы без пронуклеусов. По литературным данным как гаплоиды, так и зиготы без пронуклеусов могут быть генетически нормальными и рекомендованы для переноса, но только после проведения преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии (ПГТа) и информированного согласия пациентов.
Далее начинается этап дробления: эмбрион делится на бластомеры. Первое деление происходит через 21-30 ч после оплодотворения. В норме эмбрион делится на 2, 4, 6, 8 (и так далее) бластомеров с минимальным количеством безъядерных фрагментов. При стандартном культивировании в планшетном инкубаторе оценку эмбрионов проводят на 3-й день развития. Учитывают и описывают количество бластомеров, равномерность дробления и наличие безъядерных фрагментов.
На четвертые сутки развития эмбрион формирует морулу – структуру, образующуюся при слиянии бластомеров и напоминающую ягоду тутовника или шелковицы. Эмбрионы оценивают на 4-й день развития только в случае переноса. Далее эмбрион формирует бластоцисту: морула начинает кавитировать, образуется полость (бластоцель), часть клеток формирует внутриклеточную массу (ВКМ), из которой в будущем формируется плод, а другая часть клеток формирует трофэктодерму (ТЭ), благодаря которой происходит имплантация и формирование плаценты плода в будущем.
Бластоциста напоминает шар с комочком клеток внутри и клетками по периферии. На пятый день развития оценивают размер эмбриона, качество – количество клеток и плотность прилегания друг другу ВКМ и ТЭ. Выбирают морфологически наиболее перспективный эмбрион для переноса в полость матки, остальные перспективные эмбрионы криоконсервируют или проводят им биопсию для ПГТа и затем уже криоконсервируют.
В ряде случаев медленно развивающиеся эмбрионы, не достигшие стадии бластоцисты, или эмбрионы неудовлетворительного качества культивируют до шестого, а иногда и до седьмого дня развития.
В случае культивирования эмбриона в инкубаторе Embryoscope+ можно наблюдать полное развитие эмбриона сразу после оплодотворения и до пятого-шестого дня развития. С помощью Embryoscope+ мы можем оценить морфокинетические параметры развития эмбриона и выбрать наиболее перспективный.
Данные моменты являются ключевыми в развитии эмбриона и позволяют оценить и выбрать наиболее перспективный эмбрион. Следует отметить, что несмотря, на универсальность развития, эмбрионы от разных пациенток или даже от одной пациентки, но полученные в разных циклах с разными схемами гормональной стимуляции суперовуляции, могут иметь особенности развития, развиваться с разной скоростью и отличаться по качеству.
Как оценивают эмбрионы? На что это влияет?
Культивирование эмбрионов проводится в течение пяти или шести дней. Первый раз качество эмбрионов оцениваются на следующий день после оплодотворения. В норме эмбрионы первого дня должны иметь два чётких пронуклеуса (ядра женской и мужской гамет или, говоря иначе, половых клеток): материнский и отцовский.
Эмбрион на этой стадии называется зигота и состоит всего из одной клетки. Дробление эмбриона обычно оценивают на третьи сутки. В норме к этому моменту эмбрион состоит из восьми равных клеток или бластомеров. Иногда количество бластомеров варьирует от 6 до 12, это также вариант нормы. Кроме количества клеток оценивается наличие внеклеточных фрагментов. В зависимости от их количества эмбрионам присваивают классы: A, B, C или D, где А - отсутствие фрагментов, а D - очень высокая степень фрагментации.
Следующую оценку проводят на стадии бластоцисты на пятый день развития эмбрионов. У бластоцист оценивают степень экспандирования или размер её полости, а также оценивают внутреннюю клеточную массу и трофэктодерму (наружный слой клеток).
Размер полости варьирует от стадии 1, когда полость занимает не более половины размера эмбриона, до стадии 6, когда эмбрион полностью освобождён от блестящей оболочки. Внутренняя клеточная масса и трофэктодерма оцениваются буквами A, B и C, где А - максимальная оценка, а С - минимальная.
Важно понимать, что перечисленные выше параметры отражают только морфологические характеристики эмбриона и имеют невысокую прогностическую ценность с точки зрения вероятности имплантации. Даже идеальный внешне эмбрион может оказаться не способным к имплантации из-за генетических нарушений. И, наоборот, эмбрион с неидеальной морфологией может дать прогрессирующую беременность и рождение здорового ребёнка.
Оценка качества эмбрионов.
Для комплексной оценки эмбриона применяют генетические и морфокинетические методы оценки. Реализация генетических методов возможна только с использованием биопсии эмбрионов и последующего анализа методами преимплантационного генетического тестирования. Для морфокинетической оценки эмбрионы помещают в таймлапс инкубатор, который позволяет оценить скорость деления и продолжительность нахождения эмбриона на каждой стадии развития. Данные о морфокинетике эмбриона позволяют более точно определить его потенциал имплантации.
Качество эмбрионов определяется качеством мужской и женской гамет. Определяющим фактором при имплантации эмбриона является возраст его генетической матери. Многочисленные научные исследования показали, что возраст матери играет ключевую роль в частоте наступления беременности, при этом качество эмбриона не оказывает столь значительного эффекта на успех имплантации.
Улучшить качество эмбрионов в лаборатории практически невозможно. Задача современных приборов в лаборатории клинической эмбриологии состоит в создании условий максимально приближенных к физиологическим.
Мозаичные эмбрионы
При проведении биопсии эмбриона на стадии бластоцисты для дальнейшего генетического анализа забирают в среднем от 4 до 8 клеток трофэктодермы. Их помещают в специальную микропробирку и отправляют в генетическую лабораторию для проведения ПГТа или ПГТм. Генетическая лаборатория выдает результат по каждому эмбриону. Два основных стандартных заключения генетической лаборатории: «норма – рекомендован к переносу» или «анеуплоидный эмбрион – не рекомендован к переносу». Однако существует третий вариант заключения, в котором указывается: «мозаичная форма сегментарной дупликации/делеции хромосомы … - рекомендован с информированного согласия пациента» или «мозаичная форма моносомии/трисомии хромосомы … - рекомендован с информированного согласия пациента».
Мозаичная форма той или иной хромосомной аномалии говорит о том, что не во всех клетках биоптата присутствует данная аномалия - часть клеток остается с нормальным хромосомным набором. В заключении указывается не только характер, но и процент мозаицизма (от 30 до 80%).
Частота мозаичных эмбрионов может отличаться в разных эмбриологических лабораториях, но не должна превышать 15%. В лаборатории клиники Скайферт частота мозаичных эмбрионов составляет 7%.
Переносить ли мозаичный эмбрион?
Решение о переносе мозаичного эмбриона принимается пациентами совместно с лечащим репродуктологом после консультации клинического генетика. Врач-генетик рекомендует или не рекомендует мозаичный эмбрион для переноса, обращая внимание в первую очередь на тип хромосомной аномалии, ее локализацию и возможное клиническое значение, а также на уровень мозаицизма. Так, сегментарные мозаики несут дополнительные участки хромосом – дупликации, или у них отсутствуют определенные участки хромосом – делеции. Мозаичные по целым хромосомам эмбрионы несут дополнительную хромосому – трисомии – или у них не хватает хромосомы – моносомии.
По литературным данным результативность переносов мозаичных эмбрионов, особенно с сегментарным типом хромосомной аномалии и низким процентом мозаицизма (до 50%), сопоставима с результативностью переносов эуплоидных эмбрионов.
Криоконсервация эмбрионов – новые возможности для пациентов.
В большинстве случаев при проведении ЭКО созревает большое количество яйцеклеток, после оплодотворения которых, как правило, эмбрионов получают больше, чем необходимо для выполнения одного переноса. На сегодняшний день практически в 80 - 90% случаев пациенткам переносят 1 эмбрион, что снижает вероятность наступления многоплодной беременности и исключает связанные с ней риски. В редких случаях и только по показаниям проводится перенос сразу двух эмбрионов.
Оставшиеся эмбрионы можно криоконсервировать (заморозить) и длительное время хранить в жидком азоте при температуре -196°C. Впоследствии их можно разморозить и использовать в протоколе, если в текущем цикле ЭКО беременность не наступит или если после рождения ребенка пара захочет иметь еще детей. Перенос криоконсервированного эмбриона позволяет достигнуть желаемой беременности без проведения повторной стимуляции и пункции яичников.
Кроме того, криоконсервация эмбрионов позволяет отсрочить выполнения переноса без потери эффективности, если есть такая необходимость. Обычно эту возможность используют при повышенном риске развития синдрома гиперстимуляции или при наличии факторов, препятствующих имплантации, таких как наличие полипа или неподходящее состояние эндометрия, а также при необходимости операционного вмешательства или медикаментозной терапии для пациентки.
В случае проведения ПГТ криоконсервация также является эффективным методом сохранения эмбрионов до получения заключения об их генетическом статусе. Эта процедура позволяет отобрать эуплоидные (с нормальным набором хромосом) эмбрионы для переноса и тем самым повысить вероятность наступления беременности.
Шанс наступления беременности после переноса размороженного эмбриона, по некоторым данным, выше, чем при переносе «свежих» эмбрионов. Поэтому пациентам, у которых остались эмбрионы после цикла ЭКО, рекомендуется осуществлять их криоконсервацию.
Процедура криоконсервации эмбрионов проводится только при наличии письменного заявления - информированного согласия пациентов. В этом документе оба партнера указывают срок хранения эмбрионов, а также определяют другие юридические нюансы, связанные с использованием или прекращением хранения эмбрионов.
Криоконсервация: лабораторная практика.
Охлаждение не является физиологическим состоянием для клеток человека, в частности из-за высокой концентрации в них воды, которая при снижении температуры приводит к образованию кристаллов льда. Образование кристаллов считается основным повреждающим фактором при замораживании биологических объектов, так как они способны разрушать внутриклеточные структуры и белки, необходимые для жизнедеятельности клетки. Для предотвращения кристаллообразования и были разработаны специальные методы криоконсервации.
На сегодняшний день существуют два способа проведения криоконсервации: медленное замораживание с использованием программируемого охлаждения и быстрое - витрификация. В большом количестве исследований доказано, что наиболее эффективным методом является витрификация, так как она, по сравнению с медленной заморозкой, имеет значительно более высокие показатели выживаемости как для эмбрионов, так и для ооцитов (яйцеклеток). Также было установлено, что витрификация обеспечивает более высокие показатели жизнеспособности и имплантации размороженных эмбрионов по сравнению со свежими.
Основной принцип витрификации заключается в замещении молекул воды специальными веществами - криопротекторами, которые предотвращают образование кристаллов льда, а также способствуют стабилизации и сохранению жизненно важных для клетки белковых структур. Таким образом обеспечивается максимально целостное сохранение эмбрионов.
Хранение осуществляется при экстремально низкой температуре (-196°C), которая обеспечивается специальными емкостями для хранения - сосудами Дьюара, наполненными жидким азотом.
Витрифицировать эмбрион можно на любом этапе развития от зиготы до бластоцисты. Но наиболее предпочтительно криоконсервировать именно бластоцисты на пятый и шестой дни развития, поскольку так обеспечивается селективное преимущество, т. е. знание, какие зиготы способны образовать бластоцисту, а значит обладают большим потенциалом к имплантации.
В лабораторной практике завершающим этапом витрификации является помещение эмбриона на крионоситель. Чрезвычайной важно размещать на крионосителе то количество эмбрионов, которое в дальнейшем предполагается перереносить пациентке. Наиболее целесообразно криоконсервировать по одному эмбриону на крионосителе. В некоторых случаях возможно размещение двух эмбрионов. Каждый крионоситель в обязательном порядке маркируется специальной этикеткой. На этикетке указываются информация о пациентке (ФИО), дата криоконсервации, номер носителя и количестве эмбрионов на нем. В клинике Скайферт на этикетке присутствует штрих код, содержащий всю информацию о биоматериале и владельце.
В случае, если эмбрионам была проведена биопсия для дальнейшей генетической диагностики, они криоконсервируются по одному на носителе, и на этикетке указывается номер эмбриона, соответствующий его номеру в протоколе культивирования. Далее крионосители помешаются в криохранилище с указанием адреса хранения в карте пациента и лабораторной документации.
Как происходит разморозка?
Размораживание эмбриона - довольно простая процедура, занимающая не более 20 - 30 минут. Начинается она с подготовки специальных растворов для размораживания, а именно: нагревания одного из них до 37°C, а двух других до комнатной температуры. Далее, в соответствии с адресом, указанным в карте пациентки, из криохранилища извлекается необходимый крионоситель. Данные на этикетке проверяются двумя эмбриологами, также считывается информация со штрих кода, так же для проверки на соответствие данных. После этого начинается процедура размораживания, которая заключается в нагревании крионосителя, обнаружении эмбриона и отмывке его от криопротекторов. Далее эмбрион проверяется на морфологическую целостность под микроскопом и производится хэтчинг - рассечение блестящей оболочки, для облегчения выхода эмбриона из нее, что по литературным данным способствует имплантации. Хэтчинг проводится всем размороженным эмбрионам. После этого эмбрион помещаются в среду для культивирования для полного восстановления. Через 1-2 часа после размораживания выполняется перенос эмбриона в полость матки.
Сколько хранятся эмбрионы?
Один из наиболее часто задаваемых вопросов о криохранении - как долго эмбрионы могут быть заморожены? Принятый ответ заключается в том, что в теории эмбрионы могут выживать в криохранилище в течение десятилетий или даже столетий, а возможно даже бесконечно долго, сохраняя при этом свою жизнеспособность. Практический же опыт на сегодняшний день доказывает, что замороженные эмбрионы способны сохранять жизнеспособность после хранения в течение десятилетий. Так, на сегодняшний день известно о рождении здорового ребенка из эмбриона, который хранился в криоконсервированном состоянии в течение 30-ти лет.
Эмбриологический протокол – история развития вашего эмбриона.
Эмбриологический протокол – это запись всех этапов работы с ооцитами, сперматозоидами и эмбрионами в процессе культивирования с момента пункции (0 день или день оплодотворения) до 5-6 дня развития (до переноса, биопсии и криоконсервации).
В нем отражаются:
В зависимости от метода оплодотворения, первая запись в протокол делается в день пункции (нулевой день) или в первый день культивирования. Если применялся метод оплодотворения ICSI, то в нулевой день в эмбриологический протокол вносят показатели спермы, количество и качество ооцитов, количество зрелых, готовых к оплодотворению, и количество незрелых или анормальных клеток. В случае оплодотворения методом IVF работу с протоколом начинают с первого дня культивирования, в день пункции отмечаются только показатели спермы для оплодотворения. В первый день культивирования в протокол вносят результат оплодотворения.
Дальше протокол культивирования заполняется в зависимости от стандартов, принятых в лаборатории. В эмбриологической лаборатории клиники «Скайферт» эмбрионы оценивают на третьи и пятые сутки развития. Иногда, при необходимости, эмбрионы оценивают на второй, четвертый и шестой дни развития. Оценка эмбриона проводится по определенным алгоритмам и включает в себя оценку количества клеток, их форму и качество.
Развитие каждого эмбриона фиксируется в эмбриологическом протоколе. Кроме этого, в протоколе культивирования отмечается день переноса и количество перенесенных эмбрионов, сколько эмбрионов прошли биопсию трофэктодермы и были криоконсервированы.
Эмбрионы могут развиваться по-разному: часть из них может остановиться на ранних стадиях, часть отставать в развитии. В любом случае, специалисты используют современные технологии, накопленный опыт и индивидуальный подход в каждом протоколе ЭКО, чтобы результат был самым лучшим из возможных.
